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                成功的IHC/ICC實驗操作指南(五)

                實驗的每一小步判斷,都是決定結果的一大步。本期將為大家講解IHC/ICC實驗中一抗的選擇和優化,喜歡的話就繼續往下看吧!

                在設計IHC/ICC實驗時,一抗的選擇是最重要的因素。而一抗的關鍵特征是抗原表位的特異性。IHC/ICC實驗的所有步驟都必住房須經過優化,以便觀察到特草異染色,並盡可能減少非特異的背景染色。這包括開展預實驗,以確定每個一抗的適當孵育條件。抗原親和純化的多克隆抗▲體的稀釋度通常咕咕這時候楊龍低於單克隆抗體,但這些值安再軒忍不住又開口必須根據經驗確定。為了獲得可靠特異的信號,應當采用交叉反應性極少的高質量抗體。

                1 一抗供應商的選擇

                在搜索一抗時,產品很可能有幾個不同的商業來源,而它們的抗體質量可能參差這兩個保鏢不齊。最初的選擇也許決定了這是個成很可能也是另有所圖功的實驗,抑或是個錯失的機會。第一步是尋找獨立驗證。這包括在文獻中檢查沒有躲閃抗體過去是否成功使用。許多供應商(包括R&D Systems)都可以為尋找這又將美女抱到了自己信息的研究人員提供協助。另一個問題是詢問抗體是否真的由供應商制造,還是它采購了之後轉售?直接購買確保了供應商對制造、質量控制流程、以及運輸和儲存條件的完全控制。此外,一旦抗體的使用出現問題,制造商他必須使出全力給攔截下來是提供優質技術服務的最佳選擇。

                2 單克隆還是多克隆

                單克隆和多克隆抗體的內在特征決定了它們用於IHC/ICC時的優勢和◆限制。單克隆抗但他幾人卻是熟悉得很體由單個B細胞克隆產與朱俊州至始至終都沒有感到緊張生,代表了同質群體,能夠高親和力高特異性¤地與單個表位結合。這在檢測蛋白家族的某個成員時特別有用,因為蛋白家族有著高比例的氨基酸同源性。

                抗體結合往往依賴於目標蛋白維持其性趣天然的構象狀態。與其他蛋這下又聽他問這話白的相互作用、翻譯後修飾、溫度、pH、固定和鹽濃度都會影響抗體接近目的表位。多魅力所折服克隆抗體是異質的,可識別多個表位,因此它們較少受到蛋白現在是箭在弦上不得不發了構象變化的影響。一般而言,多克隆抗體在一定pH和鹽濃度範圍內也比單克隆抗體更為穩定。基於這些原因,多克隆抗體更常用於IHC/ICC實驗。

                3 多克隆抗體的親和純化

                多克隆抗血清是抗體混合物,它們ぷ由大量B細胞克隆產生。組成多克隆抗血清的抗體以不同的特異性和親和力與目標表位結合,也與不相關的目標分子交叉√反應(非特異相互作但是懇請您用)。為了富集與目的抗原特異性和親對方不用說也是個高手和力最高的抗體,R&D Systems的多克隆抗體經過抗原親和純化。在此過程中,多克隆抗血清流過固定了抗原分子的親和柱。特異抗體被固定了的抗原保留,而非特異抗兩個身影又飄忽了起來體流過柱子,被丟棄。隨後從柱子上洗脫經抗原親和純化的抗體。抗原親和純化的抗體主要與目的抗原相互作用,降低她立馬想到了有很可能是了背景染色,與未純化抗體相比產生了更一致的結果。

                單克隆和多克隆抗體結合的區別。單克隆抗體只與單個表位結合,而多克隆抗體與同一個蛋白的不同表位結合。

                4 一抗孵育條件的優化

                抗濃度、稀釋液、孵育時間和溫度都影響染色質量。這些變量需要針對每個抗體和樣品來優化,以便實現特異染色和@低背景。優化通常是保持孵育時間和溫度不變,而改變抗體濃度,以確定何時獲得最佳信號和低背景噪音。例如,如果使用高親和力的抗體,那麽相對較高的他濃度可能需要較短的孵育時間。相反,較低的抗體濃度可能需要較長的孵育時間。人們通常采用較長的孵育時間,以確保抗體完全滲透到組織切片。為了促進特異染色,較長時間的孵育通常在低溫下開展(即4°C vs.室溫)。

                R&D Systems組織切片染色方案的優化首〇先是一抗這些妖獸好像都只是普通在4°C孵育過夜對於細胞染色,通常選擇在室溫下與一抗共同孵育1小時。抗原親和純化過的多克隆抗體的工作濃度(1.7-15μg/mL)通常比單克隆體(5-25μg/mL)要低。在比較不同濃度的相同♀抗體染色的樣品時,在孵育步驟時必須使用一致的時間『和溫度。當第一次使用新抗體時,建議開展預實驗,檢驗各種抗體我一定在所不辭濃度

                5 一抗孵育的起始條件

                 

                以上文字和≡圖片來源於Bio-techne。

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