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                成功的IHC/ICC實驗操作指求金牌南(四)

                實驗的每一小步,都是決定結果的一大步。本期將至於剩下為大家講解IHC/ICC實驗中如何防止非特異〇性染色,喜歡的話就繼續往下看吧!

                防止非特異性染色

                用合適的方法準備和固定組織和細胞樣品之後,就可以進行染色了。所有IHC/ICC實驗都依賴於特異性的抗體-表位結合,這 千秋雪緩緩種結合是由疏水相互作用、離子相互作用、氫鍵和其他分子@間作用力來維持的不但破壞了規矩。然而,同樣這些作用力也會導致非特異性染♀色,即抗體會結合特異性抗原表位之外的氨基酸。這是IHC/ICC實驗中◥的一個普遍問題。關鍵在於要在不影♀響抗體-表位結合的前提下降真仙強者低非特異性結合。引起非特異性結合的因≡素包括一抗和二抗與血清蛋白間的相互作用、抗體和組織間的㊣離子相互作用以及抗體和能影◤響到所用的IHC檢測體系的內源性對於龍族分子之間的相互作用。這些因素會導致高№背景,使得目的抗原在相應的位置難以觀察到。使用封閉試劑封閉非特異性相互作用可以解決這類染色問題。這些需要在╱將樣品與一抗孵有之前進行。

                防止非特異性疏水相互作用

                雖然疏水①相互作用對於表位抗體的結合很關鍵,但這些作用力也會 要犯促進非特異性結合。由於一些氨★基酸具有中性側鏈,大多數蛋白質都◎有某種程度的疏水性。用熱滅活的正常血清或牛血清白蛋白(BSA)與組織藍玉柳再次出現孵育是一種常用的降低非特異〓性疏水結合的方法。正常血清類型的選擇對於防止與一抗或二抗或與待染組織/細胞的非特異性結合很重要。例如,山羊血清就不適合作為山≡羊來源的一〓抗的封閉試劑。而與二抗來源種屬相同或不千葉眼中殺機爆閃相關種屬的血清則可以用於封閉。BSA和脫脂奶粉也是常用的封閉試█劑。通常在一抗和二抗的稀釋液中也會加入這些試劑。非離子●去汙劑如0.3% Triton X-100TM或 Tween 20TM也可以降低非特異性疏水相互作用。

                血清可以有效封閉非特異性結合。A. 用生物素戰狂心中暗暗道標記的抗人CD14親和純←化多克隆抗體(貨號BAF383)檢測石蠟包〒埋的人扁桃體組織中的CD14。使用堿性抗原修復試劑盒(貨號CTS013)修復組織抗原。用HRP標記的】高靈敏度鏈黴親和素(HSS-HRP)和DAB染色並№用蘇木精復染(藍色)。B. 在平行實驗中,與一抗孵育之前用動物血清室溫下封閉15分鐘顯著降低了非特異性背景染↓色。R&D Systems的所有細胞和組織染色試劑盒中都含有HSS-HRP和動物封閉血清。

                 

                細胞和組織染色︼試劑盒和試劑

                細胞和組織染色試劑盒用於各種組織⌒學和細胞學樣品中抗原底牌吧的定位。這些試劑盒是基於親和素與結合了組Ψ 織裏目標抗原的一抗之間形成的和素-生物素復合物(ABC)的原理,設計■成即用型的規格。包含了稀釋好的↓生物素標記的二抗和 HSS-HRP,無須額外的孵育步驟,減少了手工操作的時間,降低了人為估算錯誤的風險,非常方便。

                防止非特異性離子相互作用

                如果使用的抗體和靶組織帶有相反的凈△電荷,離子相互作用就會引起非特異性背景染色。例如,相對的羧基和氨基基見海玉坤和鮮於天在那不斷來回傳音團之間的相互吸引、兩性分子之間的範德華力(一種弱靜電Ψ相互作用)都可以導致非特異性染色。增加固定劑和/或抗體稀釋緩︽沖液的離子強度可以減少離子相互作用。但是表位-抗體的結合也依賴於離子力,因此這種方法也可能降低染色的特異性。由於單表位特異性,比起∩多克隆抗體,單克隆抗體更容易受到離子強度降低的影響

                內源性酶的幹擾

                顯色檢測方◣法通常使用偶聯的酶使表位-抗體的相互作用顯現 好出來。若使用這種方法檢測,需要封閉內源性的ζ酶活性。例如,有些實驗方震天劍案使用辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP),這就可能需要相應的試劑來封閉非特異性信號。

                腎、肝或含有血管(包含紅細胞)的組織等都有內源性的過氧化物酶活性。用3-10% H2O2配制的過氧※化物酶封閉試劑可以用來防止內源性過氧化物酶剪切底物。腸、腎、淋巴和其他組織中的AP酶可以用1mM的 Levamisole封閉。腸形式的AP不受 Levamisole的影響但是可以用↙1% 的醋酸封閉。

                H2O2處理可以清除內璀璨源性過氧化物酶活性。A. 在染色前未清除內源性過氧化物酶活性的人類腎組織切片呈現出假陽性信號。組織染色用的是anti- goat HRP-DAB Cell & Tissue Stainingkit(貨號CTs0o8;褐色)。B. 同一組織在染色前於室溫下用3% H2O2的甲醇溶㊣ 液處理15分鐘,去除內源性過氧化物酶活性。

                內源性生物素的幹擾

                IHC/ICC實驗的另一種常用的檢測系統是利用鏈黴親和素與生物△素標記的一抗和二抗的結合。因此,在鏈黴親和素孵育之前必須先封閉內源性生物素。許多組織中都含有內源性生物素,包括肝、腎、心、腦和肺。將樣品與親和素孵育是封閉內源性生物素的常規方法。之後必須與生物素孵育以封閉親和素分子上額外的生物素結合位點。在用生物素/親和素封閉之是啊她是我見過最漂亮後,樣品便可以與一抗孵育。

                 

                以上文字和圖片來∴源於Bio-techne。

                 

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