北京pk10开奖结果

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                EN

                IHC實驗疑難解析大匯總

                本周小編將帶來IHC系列培訓 金魯一頓的最後一講,IHC實驗中各種常見問題的原因分析和解決方案。希望通ξ 過本次課程,您可以了解到 IHC 實驗中出現異常情況時☉您可采取的措施。

                一、切片無染色 

                IHC 中可能遇到的一個主要問題是無染色。出現這一問題的原因主要有三個:

                • 蛋白表達量低/無表達 

                • 樣本制備不※良 

                • 試劑/方案問題 

                1、表達量低/無表達

                • 確定這拔除靈魂印記得承受多大目標蛋白的表達量,用工具查詢,Uniport官網: https://www.uniprot.org/

                • 了解目標蛋白表達的種屬特異性〖和組織特異性加上祖龍玉佩,有時候目標蛋白在一些常見種屬(如:人)有表達,並不表示在其他種屬上也有∩表達。

                解決方案:

                • 在實驗前查詢文獻,確定您待檢測的目標種屬和組織的表達量情況

                • http://www.proteinatlas.org/,在這個網站上會提供人體組織的不同蛋白RNA表達數◢據和IHC數據,可以作為☆參考;

                • 在實驗方大陣就會一直存在案中添加陽性對照組織樣本,驗證實驗體系的正確性;

                • 陽性對照①的細胞系,一些情況下,可以選擇確定會表達目標蛋白的細胞系→作為陽性對照;

                • 質量優良♀的抗體說明書上會給出建議的陽性對照樣本,可以作為參考似笑非笑。

                圖1、人體不同組織的表達分布,來源:proteinatlas官網

                2、樣本制備不良

                • 固定步驟:過度固定組織或固定時間多出來不夠;固定時使用福爾馬林和多聚甲醛固定劑可能會遮蔽抗體識別的表位。

                解決方案:

                • 不同的抗原修復方法暴露表位(用 pH 6 或 pH 9 緩沖液熱修【復、酶修復等)。

                • 如果過度固定,則需要縮短固定時間。

                • 可能脫蠟」不充分

                解決方案:

                • 延長脫蠟時間,且需要使用新鮮◤二甲苯

                 

                圖2 、不同修復液對染色效果的影響

                3、試劑/方案問題

                • 一抗問題:

                • 濃度太低:按照說明書◇上的建議,梯度他為什麽不殺我稀釋抗體後實驗,選擇合適的濃度。

                • 孵ω育時間不夠:嘗試在 4°C 孵育更長時間(例如過夜)。

                • 抗體可能不適用於IHC應用,因為其可能無法識別蛋白質的天然(3D)構象。

                檢查抗體數①據表,查□ 看其是否在 IHC 中得到了驗證火焰和雷霆山丘轟然碰撞及其 IHC 的類型(石蠟切片、冰凍切片等)。抗體在免疫細胞化學(ICC)或免疫沈◆澱(IP)中的成功使用暗示了抗體能夠識別蛋白質的天然構象。  

                • 二抗問題:

                • 使用的二抗↑為抗一抗宿主的抗體(例如,如果在兔中生產一抗,則使用抗兔二抗)。檢查一抗的亞沒有去管那道裂開型是否被二抗識別。

                • 用其他蛋白的一抗檢測二抗效果,確保二『抗正常使用。

                二、高背景

                免疫組化染色之後的高背景是困擾很多實驗者的常見現象,如果您遇到類似問∑ 題,可以對Ψ照下表的分析,嘗█試相應的解決方案。

                可能的問題原因

                解決方案

                沒有封閉或封閉不足

                • 增加封閉時間▼↙,考慮更換封閉劑。如果使用血清,Abcam 推薦使用二抗種屬來〖源的正常血清(10%)封閉 1 小時。

                • 試用商業化封閉緩沖液。

                • 另一種選擇是嘗試←預吸附二抗。

                •  

                一抗濃度可好能過高

                滴定抗體至最佳濃度,進一步稀釋◣抗體並在 4℃ 孵育(緩慢孵育,但有針對性地結合效果最佳)。

                 

                孵育溫度可能過高

                • 4°C 下孵↓育切片。

                •  

                二抗可ぷ能是非特異性結合

                • 使用不加╳一抗只加二抗的對照。

                • 如果您只看到二抗非特異陽正天看著最後性染色,請更換二抗,或者使用預吸附二抗。

                •  

                組織沖洗不充分,仍殘留固定劑

                • 所有步驟之間用 PBS 充分沖洗。

                •  

                內源性過氧化物酶具有◤活性

                • 用酶抑制★劑,使用左旋咪唑≡ (2 mM) 抑制堿性磷沒有神界空間酸酶,或用H2O2(0.3% v/v) 抑制過氧化物酶。

                •  

                檢測系統是■熒光顯微鏡,固定過程引起自發熒光

                • 福爾馬林/PFA 通常在綠色光譜中出現自發熒光,因此可試用在紅〗光譜內的熒光基團。

                • 如果您有紅外檢測系統,可以使用紅外範圍內的熒光基團。

                •  

                信號擴增過多(間接技術)

                • 減少擴增孵育時間,稀釋△二抗或擴增試劑盒試劑。

                •  

                應用過多底物(酶檢測)

                • 更大倍數稀釋底物,減少底物孵育◎時間。

                •  

                色原與組織樣本中PBS 反應(酶檢測)

                • 在與底物孵育前使用 Tris 緩沖液清洗切葉紅晨頓時一驚片。

                •  

                通透破壞細胞膜並去除膜蛋白(膜蛋白)

                • 更換通透@劑(如用 Tween® 20 代替 Triton™ X-100)

                • 使用不含通透劑的緩沖液。

                三、非特異性染色

                非特異性染色也是小編在日常工作中被問到頻率較高的問題,希望下面這些建議一次性解答您的各種疑問。

                • 一抗/二抗濃度恐怕你這霸王之道可能過高。

                  • 嘗試降低抗體濃度和/或縮短孵育期。可以與不表達◣靶蛋白的陰性組織進行比較。

                • 內源性過氧化物酶具有活性。

                  • 用酶抑制劑,使用左旋咪唑 (2 mM) 抑制堿性磷酸酶,或用 H2O2 (0.3% v/v) 抑制過氧化物酶。

                • 一抗麻煩你們了是抗染色組織來源物種的抗體(例如在小鼠組織樣本上使用小鼠一抗)。當應用二抗時〇,其與組織樣本結合,因為其為抗該種屬抗體。

                  • 使用的一抗為針對與№您組織來源物種不同物種的抗體。

                  • 使用商業化試劑盒(例如,mouse on mouse 試劑盒:ab127055)。

                • 切片/細胞已經幹燥。

                  • 將切片/細胞保持在高濕度下以防變幹。

                總結

                您現在應該已經▲完全了解了 IHC 的常見疑難問題知識,包括:

                1、切片無染色的原因及解決方法;

                2、遇到高背♀景染色結果時的處理方案;

                3、排除非特異性染色時的做法。

                希望您通過這次系列培訓了解所有相笑瞇瞇關實驗知識,使您可以順利完成所有實驗。IHC 的培訓到這裏就結束了。請務必把這些信息保存在安全的地方,以備日後參考我就幫你選擇。

                 

                本文內容來源於abcam官網。

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